對生豬養殖業(yè)而言，非洲豬瘟是當前最具危險性的傳染疾病之一自2018年冬季傳入我國以來(lái)以對我國生豬養殖業(yè)帶來(lái)了巨大損失。非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種高度接觸性，致死率極高的烈性傳染病。由于非洲豬瘟臨床癥狀與豬瘟（CSF）和豬繁殖與呼吸障礙綜合征（PRRS）等病癥極其相似，所以?xún)H通過(guò)臨床癥狀無(wú)法區分，因此需要使用分子生物學(xué)手段對非洲豬瘟病毒進(jìn)行檢測，以做到對非洲豬瘟病毒及時(shí)、快速、準確的診斷，以確保將非洲豬瘟的威脅性降到最低。筆者將簡(jiǎn)述目前常見(jiàn)的非洲豬瘟病毒檢測方法及注意事項，以期為生豬養殖從業(yè)人員在非洲豬瘟病毒檢測及非瘟防控提供參考。

1 非洲豬瘟病毒檢測方法

1.1 病原學(xué)檢測

ASFV的病原學(xué)檢測，主要有聚合酶鏈式反應（PCR）、微滴數字PCR（Droplet Digital PCR, ddPCR）、線(xiàn)性指數PCR、重組酶聚合酶擴增技術(shù)（RPA）、原位雜交技術(shù)（ISH）、環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)（LAMP）、探針雜交技術(shù)等。

PCR檢測：PCR是疫病最早期采用的檢測方法，非洲豬瘟病毒的PCR檢測是根據其基因中的高度保守區序列，設計特異性引物進(jìn)行擴增，檢測和鑒定屬于所有已知病毒基因型的廣泛分離株。依據世界動(dòng)物衛生組織推薦的的PCR檢測方法，可以擴增出22株不同的ASFV病毒，但傳統PCR方法由于耗時(shí)較長(cháng)且對設備要求高，因此并未廣泛應用于養殖一線(xiàn)。

巢式PCR：采用內外兩對PCR引物，可以在檢測組織、血液樣品和培養物的基礎上，檢測昆蟲(chóng)體內所帶的ASFV。巢式PCR克服了單次擴增平臺期效應的限制，使擴增倍數提高，從而極大的提高了PCR的敏感性；并且因為模板和引物的改變，降低了非特異性反應連續放大進(jìn)行的可能性，保證了反應的特異性；由于內側引物擴增的模板是外側引物擴增的產(chǎn)物，第二階段反應能否進(jìn)行，也是對第一階段反應正確性的鑒定，因引此可以保證整個(gè)反應的準確性及可行性。

熒光定量PCR：熒光定量PCR是在常規PCR基礎上對某些特定基因如p72、p54、K205R等設計引物和探針，使得檢測特異性和敏感性得到了較大的提升。非洲豬瘟傳入中國以來(lái)，由于部分豬場(chǎng)已經(jīng)出現CSFV、ASFV以及PRRSV混合感染的情況。因此，利用多重PCR技術(shù)不但可對混合感染的豬只做及時(shí)和準確的診斷，而且還能極大程度減少檢測耗材的使用，縮短檢測時(shí)間。

微滴數字PCR檢測：ddPCR比普通熒光定量具有更高的敏感性和特異性，其采用終點(diǎn)稀釋方法實(shí)現了最小劑量單分子病毒的擴增，進(jìn)而計算出樣品的起始濃度，最終達到對病毒含量的絕對定量。但由于微滴數字PCR需要使用較為昂貴的儀器設備和試劑，因此很難用于大規模樣品的檢測。

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)：是一種“簡(jiǎn)便、快速、精確、低價(jià)”的基因擴增技術(shù)，可做到快速檢測非洲豬瘟病毒，通常30分鐘即可完成檢測。與常規PCR相比，環(huán)介導等溫擴增不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀(guān)察等過(guò)程，因此對儀器設備的要求較低，便于在養殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)、飼料廠(chǎng)進(jìn)行快速檢測，該檢測方法也是目前生產(chǎn)一線(xiàn)最常用的非洲豬瘟病毒檢測方法之一。

重組聚合酶擴增技術(shù)：重組聚合酶擴增技術(shù)是一種新興的分子學(xué)檢測方法，目前也被應用于ASFV的檢測中，其原理類(lèi)似于體內的DNA的復制過(guò)程，通過(guò)生成重組酶-DNA復合物來(lái)啟動(dòng)DNA的合成，進(jìn)而進(jìn)行目標區域的指數式擴增。由于RPA的反應溫度介于37-42℃之間，舍去了常規實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)中加熱到退火的過(guò)程，所以其反應時(shí)間可以縮短至20分鐘左右。該方法在保證了擴增敏感性和特異性的同時(shí)，又極大的縮短了檢測時(shí)間。

下圖為實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測非洲豬瘟病毒的基本原理（圖1）。

圖 1實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)原理

1.2 血清學(xué)檢測

利用抗原抗體反應進(jìn)行的抗原檢測和抗體檢測，是血清學(xué)檢測的兩種重要手段。針對ASFV抗原的檢測方法主要有熒光抗體試驗、雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗、膠體金免疫層析法等；針對ASFV抗體的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、間接熒光試驗、膠體金免疫層析技術(shù)等。

血清學(xué)抗原檢測：目前世界動(dòng)物衛生組織推薦的用于抗原鑒定的方法為熒光抗體試驗，主要用于鑒定不產(chǎn)生紅細胞吸附試驗反應的非洲豬瘟病毒毒株，通過(guò)熒光標記單抗而檢測動(dòng)物組織內的抗原；在ELISA基礎上發(fā)展起來(lái)的雙抗夾心ELISA方法，運用抗原抗體特異性結合原理，先將特異性抗體與固相載體結合，在此基礎上加入待檢抗原，然后加入酶標抗體，使得一單位的抗原同時(shí)結合兩個(gè)單位的抗體從而形成所謂的“雙抗體夾心”，最后加入底物試劑與酶標抗體結合，根據顯色深淺來(lái)判斷抗原含量。此外，ASFV的交叉引物擴增結合免疫層析快速檢測方法，不僅方便快捷，且有著(zhù)良好的敏感性。免疫膠體金技術(shù)是一種常用的標記技術(shù)，而膠體金免疫層析法則是運用類(lèi)似于側向流動(dòng)免疫色譜分析的虹吸原理，來(lái)檢測樣品中抗原的有無(wú)，適合快速檢測和流行病學(xué)調查。

血清學(xué)抗體檢測：抗體檢測是血清學(xué)檢測中最常規的方法，目前針對p72、p30、p54、K205R等ASFV蛋白，國內外都已建立了間接ELISA、競爭ELISA、阻斷ELISA等多種方法。目前市場(chǎng)上已有很多商品化ELISA試劑盒，特異性與靈敏度都非常高，是人們進(jìn)行ASFV檢測時(shí)的首選方法。同時(shí)，免疫膠體金技術(shù)針對包被分子的不同也可以用來(lái)檢測ASFV抗體，該兩種方法均是生產(chǎn)一線(xiàn)中快速診斷非洲豬瘟的方法之一。

2 非洲豬瘟病毒檢測注意事項

非洲豬瘟病毒檢測涉及樣本采集、樣本保存、樣本運輸、樣本處理與最終檢測等多個(gè)環(huán)節，一個(gè)環(huán)節出現紕漏，就極易出現假陽(yáng)性或者假陰性的錯誤檢測結果。提高檢測可靠性，避免出現假陽(yáng)性或者假陰性結果，我們需要做到以下幾點(diǎn)。

2.1 樣品端

規范樣本采集操作。隨機采樣時(shí)要注意仔細觀(guān)察豬的精神狀態(tài)，對精神狀態(tài)不好伴有發(fā)燒癥狀的豬只要重點(diǎn)采集確保不漏任何一頭；或者隨機采樣時(shí)，對全群豬只進(jìn)行間隔采集，保證不漏采任何一頭疑似豬只。當采集的樣品為組織樣時(shí)，應將樣品50%中性甘油溶液或含I00 μg/mL青霉素和鏈霉素的PBS溶液中，樣品采集完成后要置于低溫環(huán)境中保存和運輸（12h內可4℃環(huán)境中運輸），到達實(shí)驗室至檢測前應將樣品置于－20℃中保存，以保證檢測結果的準確性。

2.2 試劑端

規范化檢測試劑的保存。很大一部分假陽(yáng)性與假陰性的檢測結果，是由于檢測試劑保存不當造成的。因此我們要規范化檢測試劑的管理，做好試劑的生產(chǎn)日期及失效日期登記，并將試劑保存在適宜的環(huán)境中。

2.3 病毒檢測端

病毒檢測過(guò)程中若存在不符合操作規程的地方也會(huì )導致檢測結果出錯。核酸檢測是微量操作，要求極為嚴格。首先，要做好檢測人員的專(zhuān)業(yè)知識和實(shí)操技能的培訓，保證檢測人員在樣品處理端和加樣端的操作符合規程。另外樣品RNA提取和逆轉錄的過(guò)程對操作人員的加樣速度、超純水以及潔凈度要求較高，如果環(huán)境中存在RNA酶則會(huì )使RNA降解從而導致檢測結果出錯。因此，在病毒檢測端在保證操作環(huán)境潔凈的同時(shí)一定要確保檢測人員有著(zhù)較高的實(shí)驗室素養和實(shí)操水平。

3 總結

雖然分子生物學(xué)檢測非洲豬瘟病毒是診斷非洲豬瘟疾病最有效的、最便捷、最準確的方法，但是要確保檢測結果的真實(shí)可靠就一定要將病毒檢測過(guò)程中每一個(gè)操作步驟都執行到位，準確可靠的結果能有效防止非洲豬瘟的進(jìn)一步擴散，降低非洲豬瘟對生豬養殖業(yè)的威脅。